來自美國Jackson實驗室、中國科學(xué)院動物研究所和辛辛那提大學(xué)的研究人員報告稱，他們通過組合CRISPR-Cas9和PumilioRNA結(jié)合蛋白，構(gòu)建出了一種可用于基因調(diào)控及基因組標記的萬能系統(tǒng)，他們將之命名為Casilio系統(tǒng)。
中國科學(xué)院動物研究所基因工程技術(shù)研究組組長王皓毅(HaoyiWang)研究員，及任職于Jackson實驗室和辛辛那提大學(xué)的AlbertWCheng是這篇論文的共同通訊作者。
由于其簡易及有效，近年來CRISPR-Cas9系統(tǒng)被廣泛用于基因組編輯。核酸酶缺陷突變體dCas9蛋白可以與一些效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進行融合，這樣的融合蛋白可由sgRNAs引導(dǎo)至基因組位點來調(diào)控基因表達或標記染色體。
例如，在2013年，華人科學(xué)家齊磊（LeiS.Qi，音譯）就開發(fā)出了一種稱作為CRISPR干擾（CRISPRi）的系統(tǒng)。在這一系統(tǒng)中，是將缺失核酸內(nèi)切酶活性的Cas9與一種導(dǎo)向RNA共表達，由此產(chǎn)生一種DNA識別復(fù)合物，這種復(fù)合物能特異性干擾轉(zhuǎn)錄延伸，RNA聚合酶結(jié)合，或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。這種RNA導(dǎo)向的DNA識別平臺是基因組范圍內(nèi)基因表達選擇性抑制的一種簡單的新方法（延伸閱讀：華裔博士連發(fā)Cell，Nature：基因沉默新技術(shù)）。
然而，由于獨特的sgRNA:Cas9配對，在大多數(shù)這樣的實驗中只能應(yīng)用一種類型的效應(yīng)蛋白。直接融合多個拷貝的效應(yīng)蛋白與dCas9來獲得充分的效應(yīng)蛋白活性存在著技術(shù)挑戰(zhàn)。結(jié)合利用MS2和PP7一類病毒RNA序列的RNA適配子方法與CRISPR-Cas9系統(tǒng)為提高多路復(fù)用性及多聚化提供了工具，但當(dāng)前只有有限數(shù)量充分確定特征的RNA適配子。并且，將三個或以上拷貝的這些結(jié)構(gòu)化適配子整合到sgRNA上會降低sgRNA表達，由此限制了可招募效應(yīng)蛋白的數(shù)量。
在這篇文章中研究人員報告通過組合CRISPR-Cas9和PumilioRNA結(jié)合蛋白建立了Casilio系統(tǒng)。Pumilio和FBF蛋白都具有一個保守的Pumilio/FBF(PUF)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域??這一結(jié)構(gòu)域可編程來結(jié)合一種特異的8-merRNA序列（PUF結(jié)合位點，PBS）。這一Casilio系統(tǒng)是由dCas9蛋白，附帶有一個或以上PUF結(jié)合位點的一條sgRNA(sgRNA-PBS)，和與PUF結(jié)構(gòu)域融合的一個效應(yīng)蛋白（PUF融合蛋白）所構(gòu)成。
研究人員證實這一Casilio系統(tǒng)可實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，表觀遺傳修飾蛋白及熒光蛋白在定義基因組位點上的多路復(fù)用及多聚化。Casilio系統(tǒng)的主要優(yōu)點包括有：(I)多路復(fù)用性�？赏瑫r將不同的Casilio模塊傳送到細胞中，每個模塊可在定義靶位點上運作，獨立發(fā)揮作用。由于可以很容易地編程PUF結(jié)構(gòu)域來識別所有8-merRNA模體，這樣大大擴展了獨立Casilio模體的潛在數(shù)量。
(II)多聚化。線性8-merPBS模體簡易性可實現(xiàn)sgRNA-PBS上廣泛的PUF融合蛋白多聚化，且不會阻礙sgRNA轉(zhuǎn)錄或dCas9/sgRNADNA結(jié)合活性。這一特征使得能夠?qū)⒍鄠�PUF融合蛋白分子組裝到sgRNA上，在局部集中效應(yīng)蛋白或蛋白質(zhì)標記。這對于熒光成像或轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤其有用。
(III)復(fù)合物形成。通過進一步的開發(fā)和優(yōu)化，sgRNA-PBS有潛力成為PUF引導(dǎo)組裝化學(xué)計量確定的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一個RNA支架。
考慮到這些優(yōu)點，作者們表示相信這一Casilio系統(tǒng)將為研究基因功能和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種強大工具。
王皓毅在麻省理工學(xué)院RudolfJaenisch實驗室進行博士后研究時就曾參與了CRISPR技術(shù)的早期開發(fā)，近年來發(fā)表了一系列介紹CRISPR技術(shù)的重要文章。
此前，在《MammGenome》雜志上發(fā)表的一篇文章中，王皓毅研究員和合著者們不僅簡要地為我們概述了這一快速發(fā)展的領(lǐng)域，介紹了CRISPR?Cas9系統(tǒng)以及它在基因組編輯中的應(yīng)用，還著重介紹了設(shè)計CRISPR/Cas9向?qū)NA(guideRNA,gRNAs)的基本要點，減少脫靶效應(yīng)的策略，利用CRISPR/Cas9構(gòu)建小鼠模型的基本策略和注意事項，以及CRISPR/Cas9當(dāng)前面臨的一些挑戰(zhàn)以及未來的發(fā)展。
在發(fā)表于《Genetics》雜志上的另一篇研究論文中，王皓毅研究員證實利用電流來傳送CRISPR/Cas9系統(tǒng)，不僅使得CRISPR/Cas9能夠高效地實現(xiàn)實驗室小鼠遺傳改造，并且可顯著提高這一系統(tǒng)的通量）。
本文來自：逍遙右腦記憶 http://m.yy-art.cn/chuzhong/364813.html
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