近期，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的研究人員在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature子刊《ScientificReports》發(fā)表研究成果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以用基因編輯技術(shù)??TALENs，制備了同基因的白血病細(xì)胞克隆，并破壞了其中的FLT3基因，從而證明這種基因組編輯方法，是探索基因突變分子基礎(chǔ)的強(qiáng)有力的平臺(tái)。
急性白血病(AL)是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在遺傳構(gòu)成和臨床結(jié)局表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。由于對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)/基因突變的了解加深，以及相應(yīng)靶向療法的引入，在某些白血病亞型的治療方面已經(jīng)獲得了驚人的成功，但是，許多遺傳高風(fēng)險(xiǎn)的亞型，目前用標(biāo)準(zhǔn)方案仍然是難以治療的，并表現(xiàn)出預(yù)后不良。世界衛(wèi)生組織和美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)越來越多地基于遺傳傾向?qū)L進(jìn)行分類，凸顯了細(xì)胞遺傳學(xué)/基因突變對(duì)于臨床管理決策制定的深遠(yuǎn)影響。因此，迫切需要對(duì)這些AL患者的分子病理基礎(chǔ)進(jìn)行剖析，以開發(fā)新型的治療策略。
相比較候選基因分析法，高通量測(cè)序技術(shù)所取得的進(jìn)展，可讓我們從全基因組的角度，以公正和全面的方式，對(duì)AL進(jìn)行表征。在AL中高復(fù)發(fā)的基因突變的鑒定，為改進(jìn)診斷方法、病人分層和靶向治療，提供了寶貴的基礎(chǔ)原理。然而，雖然已經(jīng)出現(xiàn)了詳盡的AL基因組草圖，但是，闡明這些經(jīng)常發(fā)生的基因突變與臨床表型和治療結(jié)果有何關(guān)聯(lián)，還是比較困難的。確定這些個(gè)體遺傳異常的臨床相關(guān)性，是非常必要的。更重要的是，揭開白血病生物學(xué)關(guān)鍵的分子事件??人類基因組時(shí)代的重大挑戰(zhàn)，從根本上來說對(duì)于未來的遺傳醫(yī)學(xué)也是非常重要的。
目前已有幾種方法被廣泛用于探索一個(gè)給定基因突變的分子機(jī)制。利用基因工程策略，研究人員已經(jīng)建立了許多白血病動(dòng)物模型，并為白血病的驅(qū)動(dòng)因素提供了有說服力的見解。在未來幾年中，基因工程動(dòng)物模型將仍然是“研究遺傳缺陷和臨床表型之間的關(guān)聯(lián)”最可靠的工具，并有助于設(shè)計(jì)和開發(fā)新的分子靶向策略。
然而，動(dòng)物模型的方法有一些固有的缺點(diǎn)。例如，動(dòng)物模型可能并不總能準(zhǔn)確地模擬臨床背景相關(guān)的白血病表型，產(chǎn)生和維護(hù)轉(zhuǎn)基因模型的過程也很耗時(shí)和昂貴。另外，細(xì)胞株和主要樣本為基礎(chǔ)的模型，也被廣泛用于探索導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表型的關(guān)鍵分子事件。主要樣本之間遺傳背景的巨大差異、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)/敲除的非生理水平和隨機(jī)整合病毒載體引入的干擾，都限制了實(shí)際的分子機(jī)制。因此，在后基因組時(shí)代，迫切需要新的分析工具，來闡明白血病相關(guān)基因功能的分子機(jī)制。
轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(TALE)核酸酶(TALENs)??一種高效的基因組編輯工具，是人工融合蛋白，含有的核酸內(nèi)切酶FokI的催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)設(shè)計(jì)的TALEDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域??可識(shí)別特定的DNA序列。兩個(gè)單獨(dú)的TALENs結(jié)合到相鄰的DNA序列，使FokI能夠二聚化，靶DNA能夠裂解，從而引入位點(diǎn)特異性的雙鏈斷裂(DSBs)。
隨后，通過同源性指導(dǎo)修復(fù)或非同源末端連接(NHEJ)通路的細(xì)胞DNA修復(fù)被激活。迄今為止，基因組編輯技術(shù)已成功地用來誘導(dǎo)小鼠正常造血干細(xì)胞中的骨髓惡性腫瘤。然而，很少有研究采用這項(xiàng)技術(shù)，在白血病中調(diào)查個(gè)別基因異常引發(fā)的分子事件。
在這項(xiàng)研究中，研究人員制備了同基因的白血病細(xì)胞克隆，用TALENs技術(shù)破壞了其中的FLT3基因。并將具有單等位基因破壞的FLT3的同基因克隆，與等基因的野生型對(duì)照克隆和親本的白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)、下游FLT3信號(hào)和增殖能力，進(jìn)行了比較。研究人員采用RNA-seq，將突變型K562克隆及其相應(yīng)的野生型對(duì)照組的全基因表達(dá)譜，進(jìn)行了比較。
研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3的轉(zhuǎn)錄水平和配體依賴性自身磷酸化，在突變克隆中是下降的。TALENs介導(dǎo)的FLT3基因單倍不足，可損壞體外細(xì)胞增殖和集落形成。這種抑制作用是被維持在體內(nèi)的，從而提高了移植有突變K562克隆的NOD/SCID小鼠的存活率。聚類分析表明，同基因克隆的基因表達(dá)模式，是由FLT3突變體的狀態(tài)??而不是單個(gè)同基因克隆之間的偏差，所決定的。突變體和野生型之間差異表達(dá)的基因，揭示出突變K562克隆以及抑制的FLT3信號(hào)中無義介導(dǎo)的衰退通路的激活。
總而言之，這項(xiàng)研究支持，這種基因組編輯方法是探索基因突變的分子基礎(chǔ)的一種強(qiáng)大和普遍適用的平臺(tái)。
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