來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、北京生命科學(xué)研究所（NIBS）的研究人員借助于CRISPR/Cas9系統(tǒng)證實了，在非經(jīng)典末端連接中連接酶I（LigaseI）和連接酶III（ligaseIII）介導(dǎo)了DNA雙鏈斷裂連接。這項研究發(fā)布在1月19日的《美國國家科學(xué)院院刊》（PNAS）上。

論文的通訊作者是任職于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院和北京生命科學(xué)研究所的張昱（YuZhang）研究員。張博士的主要興趣是研究影響染色體轉(zhuǎn)位發(fā)生的新因子，及研究癌癥起始和發(fā)展中導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的分子機制。

作為最重要的遺傳物質(zhì)，DNA持續(xù)發(fā)生不同程度的損傷。DNA修復(fù)不僅對維持正常細(xì)胞中的基因組穩(wěn)定極為重要，也廣泛地參與了癌變及進化。DNA雙鏈雙鏈斷裂（DSB）是危害最大卻普遍存在的DNA損傷形式，每個細(xì)胞每天大約經(jīng)歷10-100次DSB。DSB直接破壞染色體的物理連續(xù)性，若無法及時修復(fù)，可能因整段染色體的丟失而造成細(xì)胞衰老、凋亡或癌變。

DSB主要通過兩種途徑進行修復(fù)：同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）。HR以完全相同的染色體作為模板執(zhí)行精確的修復(fù)，但僅發(fā)生在DNA經(jīng)歷或完成復(fù)制的S期和G2期。NHEJ可在整個細(xì)胞周期發(fā)生，因為修復(fù)不需要模板，只基于斷裂末端的結(jié)構(gòu)而容易產(chǎn)生錯誤。哺乳動物細(xì)胞中的DSB主要通過NHEJ修復(fù)。

盡管在過去的20年里已對NHEJ信號通路的組成元件進行了廣泛地研究，有研究觀察到在各種情況下，缺失核心經(jīng)典NHEJ因子如DNA連接酶IV(Lig4)的細(xì)胞中有著顯著的DSB末端連接活動，表明存在非經(jīng)典末端連接(A-EJ)活動。

在哺乳動物中已知的DNA連接酶只有Lig1、Lig3和Lig4。在這篇PNAS文章中，研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建出了小鼠CH12F3細(xì)胞系??在這些細(xì)胞中，除刪除Lig4以外，細(xì)胞核中Lig1或Lig3被完全刪除（這代表著細(xì)胞只包含一種DNA連接酶：Lig1或Lig3）。令人驚訝地是，研究人員發(fā)現(xiàn)包含Lig1和Lig3的復(fù)合物均可高效促進A-EJ介導(dǎo)的DSB修復(fù)，包括IgH位點的類別轉(zhuǎn)換重組（CSB），CRISPR/Cas9在DSBs之間介導(dǎo)的染色體缺失。但在Lig4/細(xì)胞中只刪除細(xì)胞核Lig3而不刪除Lig1會顯著減少染色體間轉(zhuǎn)位，表明Lig3在催化染色體轉(zhuǎn)位中發(fā)揮了獨特的作用。對染色體轉(zhuǎn)位連接處的微同源序列（microhomology）進行序列分析，揭示出了包含不同連接酶的復(fù)合物的特異性。這些數(shù)據(jù)表明在A-EJ中存在包含不同DNA連接酶的復(fù)合物。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法。CRISPR/Cas9來源于簡單的細(xì)菌免疫系統(tǒng),經(jīng)過人為改造后,可在真核細(xì)胞中實現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯。相比傳統(tǒng)方法，CRISPR/Cas9提供具有許多的優(yōu)勢：設(shè)計簡單、高效率和相對更低的成本花費。近兩年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛用于解決各種生物學(xué)基礎(chǔ)問題。

近期，荷蘭癌癥研究所遺傳學(xué)教授ReuvenAgami與和同事們應(yīng)用CRISPR搜尋了整個基因組中的調(diào)控增強子元件，闡明了p53和Erα兩種蛋白的關(guān)鍵增強子序列。來自北京中醫(yī)藥大學(xué)、北京大學(xué)的研究人員報告稱，她們采用CRISPR/CAS9介導(dǎo)基因組編輯miRNA-155，成功抑制了小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中的促炎性細(xì)胞因子生成。還有來自華東師范大學(xué)的研究人員報告稱，他們采用Cas9蛋白來刪除基因組大片段及敲入功能性基因盒（genecassette），完成了對嚙齒動物單細(xì)胞胚胎的基因組編輯。

本文來自：逍遙右腦記憶 http://m.yy-art.cn/gaozhong/868748.html

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