蛋白質(zhì)鹽析實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)步驟

一、注意事項(xiàng)：

1. 鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，溶液pH值越接近蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。

2. 鹽析一般用的硫酸銨，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60攝氏度烘干后再稱量，這樣更準(zhǔn)確。

3. 在加入鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。

4. 鹽析后最好攪拌40分鐘到一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放置一段時(shí)間。3.5為了避免鹽對(duì)酶的影響，一般脫鹽處理后再測(cè)酶活性。

5. 鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾或者G-25，G-50 處理。

6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸銨濃度在70%左右。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最多的硫酸銨，由下表可以看出：它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大(20度時(shí)飽和溶液為754克/升;0度時(shí)飽和溶解度為706克/升)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。

表1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度(克/100毫升水)

0℃

20℃

80℃

100 ℃

(NH4)2SO4

70.6

75.4

95.3

103

Na2SO4

4.9

18.9

43.3

42.2

NaH2PO4

1.6

7.8

93.8

101

飽和硫酸銨法：

1. 取x ml血清加x ml生理鹽水，于攪拌下逐滴加入2xml飽和硫酸銨，硫酸銨的終飽和度為50%。

2. 4℃，3h以上，使其充分沉淀離心(3000rpm),20min,充上清，以xml生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨x/2ml。

3. 置4℃3h以上，[此時(shí)，(NH4)2SO4的飽和度為33%]重復(fù)上述第二步過程1～2次。末次離心后所得沉淀物為蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml裝入透析袋。

4. 對(duì)PBS充分透析、換液3次，至萘氏試劑測(cè)透析外液無黃色，即無NH4+為止。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙)，用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。

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