1、目的基因的獲取
（1）目的基因是指： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
（2）獲取方法：①從基因文庫中獲取；②人工合成（反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法）；③PCR技術(shù)擴增目的基因。
2、基因表達載體的構(gòu)建
（1）目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。
（2）組成：目的基因+啟動子+終止子+標記基因。如圖：
①啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
②終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。
③標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。
（3）基因表達載體的構(gòu)建過程：
3、將目的基因?qū)胧荏w細胞
（1）轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。
（2）常用的轉(zhuǎn)化方法：
| 生物種類 | 植物細胞 | 動物細胞 | 微生物細胞 |
| 常用方法 | 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 | 顯微注射技術(shù) | Ca2+處理法 |
| 受體細胞 | 體細胞 | 受精卵 | 原核細胞 |
| 轉(zhuǎn)化過程 | 將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達 | 將含有目的基因的表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物 | Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子 |
4、目的基因的檢測和表達
（1）首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交技術(shù)。
（2）其次還要檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是用標記的目的基因作探針與mRNA雜交。
（3）最后檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原--抗體雜交。
（4）有時還需進行個體生物學(xué)水平的鑒定。如轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。
知識點撥：
1、構(gòu)建基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。
2、PCR技術(shù)：是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。PCR擴增是獲取目的基岡的一種非常有用的方法，也是進行分子鑒定和檢測的一種很靈敏的方法。目的：通過指數(shù)式擴增獲取大量的目的基因。
3、基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，基因文庫中的基因保存在受體菌中。
4、在基因工程的四個操作步驟中，只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對。
5、原核生物繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少，有利于目的基因的復(fù)制與表達，因此常用大腸桿菌等原核生物作為受俸細胞。
6、植物細胞的全能性較高，可經(jīng)植物組織培養(yǎng)過程成為完整植物體，因此受體細胞可以是受精卵也可以是體細胞；動物基因工程中的受體細胞一般是受精卵。
7、轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是目的基因整合到受體細胞染色體基因組中，從而使受體生物獲得了新的遺傳特性的現(xiàn)象，從其變化的實質(zhì)看，這種變異屬于可遺傳變異中的基因重組。
知識拓展：
1、基因文庫的構(gòu)建：
（1）概念
①基因組文庫：含有一種生物的全部基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因組文庫。
②cDNA文庫：只包含了一種生物的部分基因。
（2）構(gòu)建過程
| 基因組文庫的構(gòu)建 | cDNA文庫的構(gòu)建 |
 |  |
（1）反轉(zhuǎn)錄法：
（2）人工合成目的基因
3、PCR技術(shù)擴增目的基因
①原理：DNA雙鏈復(fù)制
②過程：
第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；
第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補DNA鏈；
第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。
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現(xiàn)代生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用：
1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種：是指按照人們的意愿，把一種生物的某個基因克隆出來，加以修飾和改造，再轉(zhuǎn)移到另一種生物的細胞里，從而定向地改造生物的遺傳性狀。包括目的基因的制備和目的基因?qū)胧荏w細胞的過程。
2、轉(zhuǎn)基因植物的實例：轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因耐貯藏番茄、轉(zhuǎn)基因抗蟲作物（抗蟲棉、抗蟲玉米、抗蟲楊樹和抗蟲甘藍）、抗除草劑作物。
3、轉(zhuǎn)基因動物的實例：超級小鼠、綿羊、兔等。
4、細胞雜交育種：指將同類或不同類生物體地原生質(zhì)體或體細胞，在一定的物理或化學(xué)條件下進行融合形成雜種細胞，再創(chuàng)造條件將雜種細胞培養(yǎng)成完整的雜種生物個體。（如馬鈴薯--番茄植株和白菜——甘藍）
相關(guān)高中生物知識點：DNA重組技術(shù)的基本工具
DNA重組技術(shù)的基本工具：
1、基因工程的概念：
| 基因工程的別名 | 基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù) |
| 操作環(huán)境 | 生物體外 |
| 操作對象 | 基因 |
| 操作水平 | DNA分子水平 |
| 基本過程 | 剪切→拼接→導(dǎo)入→表達 |
| 結(jié)果 | 人類需要的基因產(chǎn)物 |
（1）“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）
①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。
②功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。
③結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
即當限制性內(nèi)切酶作用于特定的DNA時，把這段序列沿著特定的切點切開的這個過程分兩種情況：
a、沿著中軸線切口（即沿著DNA雙鏈中對應(yīng)的磷酸二酯鍵）切開，得到的就是兩個平末端；
b、在中軸線的兩端切口切開，得到的就是兩個黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶就可以識別G/AATTC的DNA序列，然后在G和A間切開，得到的就是兩個黏性末端（之間可以根據(jù)堿基互補配對原則重組）限制酶的切口不都是一長一短的，一長一短的叫黏性末端，一樣長的叫平末端�！罢承阅┒恕痹诟咧薪滩闹幸沧鳌梆ば阅┒恕�。如圖：
（2）“分子縫合針”——DNA連接酶
| 種類 | E·coli-DNA連接酶 | T4-DNA連接酶 |
| 來源 | 大腸桿菌 | T4噬菌體 |
| 功能特性 | 只能將雙鏈DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來 | 縫合兩種末端，但連接平末端之間的效率較低 |
| 相同點 | 都縫合磷酸二酯鍵，如圖： | |
（3）“分子運輸車”——載體
①載體具備的條件：能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存；具有一至多個限制酶切點，供外源DNA片段插入；具有標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。
②最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。
③其它載體：噬菌體的衍生物、動植物病毒
知識點撥：
1、限制酶識別的序列的特點：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是奇數(shù)個堿基還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，如圖，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。如
以中心線為軸，兩側(cè)堿基互補對稱；
以
為軸，兩側(cè)堿基互補對稱。
2、獲取目的基因和切割載體時使用同種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。
3、獲取一個目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生 4個黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位點的選擇必須保證標記基因的完整性，以便于檢測。
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